下っ端研究者のメモ

エタノール沈殿

核酸を沈殿させる基本テクニック

-DNA (RNA) の溶液に対して 1/10量の 3M 酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを入れ混和
-80°Cで10分以上冷却
-20,000g, 15 min, 4°C
-上清を捨て、氷冷した70%エタノールを加える
-29,000g, 15 min, 4°C
-上清を捨て、減圧乾燥
-ミリQ等で溶解

DNAの時はpHを調製しなくても問題はないが、RNAの時は酢酸でpHを5.2に合わせること。

大腸菌のコンピテントセル調製

塩化ルビジウム法はうまくいくと、井上法に比べコンピテンシーが高いといわれています。
ただ、井上法に比べると作製条件がシビアなようです

1日目
-大腸菌をLBに植菌し、37°Cで一晩培養
-TB1とTB2を調製しておく

2日目
-前日からの培養液1mlを100mlのLBに植継
-37°CでOD600が0.3-0.4になるまで培養
-50 mlのファルコンチューブ2本に分注し、5分間氷冷
-遠心分離 (2500g, 15 min, 4°C) し、上清をデカントで捨てる
-TB1を20 mlずつ加え、ファルコンチューブを揺らして菌体を懸濁する
-氷上に10分間静置し、遠心分離 (2500g, 15 min, 4°C)
-上清をデカントで捨てTB2を2 mlずつ加え、ファルコンチューブを揺らして菌体を懸濁
-氷上に5分間静置し、100 µlずつエッペンチューブに分注
-液体窒素で凍結し、-80°Cで保存


TB1

KOAc               30 mM
RbCl                100 mM
CaCl₂･2H₂O    10 mM
MnCl₂･4H2O    60 mM
glycerol             15% (v/v)

酢酸でpH5.8に調製
フィルター滅菌

TB2

MOPS               10 mM
CaCl₂･2H₂O     100 mM
RbCl                  10 mM
glycerol              15% (v/v)

KOHでpH6.5に調製
フィルター滅菌