大腸菌のコンピテントセル調製
塩化ルビジウム法はうまくいくと、井上法に比べコンピテンシーが高いといわれています。
ただ、井上法に比べると作製条件がシビアなようです
1日目
-大腸菌をLBに植菌し、37°Cで一晩培養
-TB1とTB2を調製しておく
2日目
-前日からの培養液1mlを100mlのLBに植継
-37°CでOD600が0.3-0.4になるまで培養
-50 mlのファルコンチューブ2本に分注し、5分間氷冷
-遠心分離 (2500g, 15 min, 4°C) し、上清をデカントで捨てる
-TB1を20 mlずつ加え、ファルコンチューブを揺らして菌体を懸濁する
-氷上に10分間静置し、遠心分離 (2500g, 15 min, 4°C)
-上清をデカントで捨てTB2を2 mlずつ加え、ファルコンチューブを揺らして菌体を懸濁
-氷上に5分間静置し、100 µlずつエッペンチューブに分注
-液体窒素で凍結し、-80°Cで保存
TB1
KOAc 30 mM
RbCl 100 mM
CaCl2・2H2O 10 mM
MnCl2・4H2O 60 mM
glycerol 15% (v/v)
酢酸でpH5.8に調製
フィルター滅菌
TB2
MOPS 10 mM
CaCl2・2H2O 100 mM
RbCl 10 mM
glycerol 15% (v/v)
KOHでpH6.5に調製
フィルター滅菌
http://ajaja.blog.shinobi.jp/protocol/%E3%82%B3%E3%83%B3%E3%83%94%E3%83%86%E3%83%B3%E3%83%88%E3%82%BB%E3%83%AB%E8%AA%BF%E8%A3%BD%20%E5%A1%A9%E5%8C%96%E3%83%AB%E3%83%93%E3%82%B8%E3%82%A6%E3%83%A0%E6%B3%95コンピテントセル調製 塩化ルビジウム法