下っ端研究者のメモ

BLASTをインストールしたときのメモ (CentOS 6.5)


NCBIからblastをダウンロード
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/

BLAST+ (新しい) というのとlegacy BLAST (古い) というのがあるが、legacy BLASTの2.2.19をダウンロード

BLAST+が僕の使いたいゲノムアノテーションパイプラインに対応していないため、legacy BLASTを使用

ダウンロードしたら解凍

$ cd /home/user
$ tar -xvf blast-2.2.19-x64-linux.tar.gz


~/.bashrc にパスを追加

$ vim ~/.bashrc

export PATH=/home/user/blast-2.2.19/bin:$PATH

$source ~/.bashrc

blastallと打ってみて、下のように表示されればOK

$ blastll　

blastall 2.2.19   arguments:

  -p  Program Name [String]
  -d  Database [String]
    default = nr
  -i  Query File [File In]
    default = stdin
  -e  Expectation value (E) [Real]
    default = 10.0
  -m  alignment view options:



設定ファイルとして

~/.ncbirc を作成し、以下を追加

$ vim ~/.ncbirc

[NCBI]

Data=/home/user/blast-2.2.19/data

[BLAST]

BLASTDB=/home/user/blast-2.2.19/db



ひとまずインストール完了、後はデータベースの作成

大腸菌で異種タンパクの発現について。

ODをチェックしてIPTGで誘導をかけるのはめんどくさいので、最近オートインダクションを多様しています。
また、オートインダクションは培地の液量あたりで得られる菌体量がIPTGに比べて多いので得られるタンパク量も多くなります。

時々、オートインダクションで発現しなくてIPTGで発現するものもあるようです。

炭素源にグルコースとラクトースを培地に加えておくと、大腸菌がグルコースを食べ終わってからラクトースを食べ始める。
ラクトースがアロラクトースに変換され、lacリプレッサーと結合することでlacリプレッサーがlacオペレーターから離れるので、目的遺伝子の転写が始まるというメカニズムです。

β-ガラクトシダーゼ (lacZ)、ラクトースパーミアーゼ (lacY)　欠損株ではインダクションがかかりません。

追記: blue-white selectionに使える株、つまりJM109などはlacZが欠失しているので使えません。

BL21 (DE3) とpET系がよく使われていると思いますが、この組み合わせはもちろん使えます。


培地の組成 (TB ベース)

A
トリプトン　　　　　　　　　　12 g
イーストエクストラクト　　　　24 g
　　　　　　　　　　　　　　　860 mlにメスアップ

B
KH2PO4　　　　　　　　　　　2.2 g
K2HPO4　　　　　　　　　　　9.4 g
　　　　　　　　　　　　　　　100 mlにメスアップ

AとBをそれぞれオートクレーブで滅菌し、室温まで冷えたら混合
60% グリセロール 10 ml、10% グルコース 5 ml、8% ラクトース 25 mlを加え完成


TBベースでなくても、LBや2xYTにグリセロール、グルコース、ラクトースを加えてあげればオートインダクション培地ができます。

発現は、LB + 1% グルコースで一晩培養し、オートインダクション培地に植継
植継ぐ量は培地の1/1000

37°Cでは12 h
30°Cでは24 h

培養してあげれば目的タンパクが発現しているはず。

試験官で発現条件のスクリーニングをする時は、培地を3~5 ml入れて大腸菌のコロニーを直接オートインダクション培地に植菌してあげればOKです。