下っ端研究者のメモ

大腸菌での膜タンパク質発現②

膜タンパク質を可溶性タンパク質として発現させる方法を紹介しました。

大腸菌での膜タンパク質の発現①


今回は、大腸菌のシグナルペプチドを目的タンパクのN末端に付加することで大腸菌の膜に発現させる方法。

まずは、目的タンパクのN末端にシグナルペプチドがあるか調べます。

目的タンパクのアミノ酸配列をSignalPになげてあげればシグナルペプチドと切断部位を予測してくれます。

SignalP
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/


次に、大腸菌のシグナルペプチドについて。
大腸菌の膜タンパクはいくつかありますが、異種発現に使われるものはPelBとOmpAのシグナルペプチドです。

PelB
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA

OmpA
MKKTAIAIAVALAGFATVAQA

 

SignalPで予測したシグナルペプチドをOmpAもしくはPelBのシグナルペプチドに置換した変異体を作製します。

少しプライマーが長くなりますが、
pelBの時は

5-ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC--目的遺伝子の配列-3

OmpAの時は

5-ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC--目的遺伝子の配列-3

というフォワードプライマーとリバースプライマー (ジーンスペシフィックプライマー) を使ってPCRでキメラ遺伝子を作製し、発現ベクターにのせます。

あとは大腸菌で常法に従って発現させます。
個人的には、膜に発現させる時はBL21よりもC41のようなストレス耐性株の方がうまく発現できることが多いです。


ちなみに、PCRでキメラを作らなくてもpET22はPelBのシグナル配列、SigmaのpFLAG-ATSはOmpAのシグナル配列があるのでコンストラクトの構築は簡単です。

大腸菌での膜タンパク質発現 ①

膜タンパク質を発現させる時は

膜貫通領域を除いて可溶性タンパク質として発現させる。
大腸菌のシグナル配列を用いて大腸菌の膜に発現させる。

の2通りがある。

今回は膜貫通領域を除いて可溶性タンパク質として発現させる方法。

もちろん、トランスポーターのような複数膜貫通ドメインがある膜タンパク質には適用できません。


まずは、膜貫通領域をTMHMMで予測。
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/

配列をfasta形式でいれるとこんな結果がでます。



このタンパク質は膜貫通領域は12-29番目のアミノ酸なので、Met続いて30番目のアミノ酸-------となるようにコンストラクトを作製。

C末端に膜貫通領域があれば、膜貫通領域の直前にストップコドンをいれてあげればOK。


あとは常法に従って一般的な可溶性タンパク質と大腸菌で発現させる。



膜貫通領域を欠失しても、膜画分に目的タンパク質が局在する時があります。
膜に貫通はしていないが、タンパク表面の疎水性領域が細胞膜と相互作用しているからだと考えられます。
こういう時は大腸菌破砕時に界面活性剤を加えてあげることで可溶性画分に回収可能です。