下っ端研究者のメモ

バキュロウイルス発現系

invitrogenのBac-to-Bac Baculovirus Expression Systemを使用しています。

これはAcNPVのゲノムに大腸菌の複製起点を導入したbacmid (たぶんbaculovirusとplasmid をくっつけた造語) に大腸菌内でトランスポゾンを使って目的の遺伝子発現ユニットを入れるシステム。

bacmidをSf9にトランスフェクションしてあげると、ウイルス粒子ができでくるので、それをSf9にインフェクションしてあげるとウイルスを増やせたり、目的タンパク質を発現させることができます。



まずは、pFastbacに目的遺伝子を入れます。
特に注意することはなく、ポリへドリンプロモーターとポリA付加シグナルの間にスタートコドンからストップコドンだけを入れればOK。コザックシークエンス等はいりません


プラスミドができたらDH10BACという大腸菌に導入
DH10BACはbacmidとトランスポゼースを乗っけたプラスミドを持っています。
DH10BACのコンピは一度invitrogenから買えば、その後はコンピを自作して使えます。


回復培養は37°Cで4時間
この間にトランスポゾンでbacmidを組み換える

培養液30 µl、1 M IPTG 30 µl、2% X-gal 30 µlを クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ゲンタマイシンの入ったLB プレートにまく。

37°Cで2日間培養
1日ではコロニーが青くなりません

白コロニーをピックし、トランスフェクショングレードのミニプレップやミディプレップキットでbacmidを調製
僕はqiagenのplasmid mini kitを使っています。

本当に組み換えが起こったbacmidかを確認するためには、M13FWとM13RVプライマーを使ってPCRをかければ判断できます。
今のところ、ハズレを引いたことはありませんが、もしもがあると嫌なので毎回PCRで確認しています

Sf9細胞の培養方法とバキュロウイルスを使ったタンパク質の発現のメモ

Sf9細胞 Spodoptera frugiperda (JE Smith) ツマジロクサヨトウ 卵巣由来
細胞はインビトロジェンのSf9 cells in Sf-900II SFM
培地は、Sf-900II SFM
血清は、GibcoのFetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, US originを使ってます

インキュベーターは28度にあわせてあります

今の研究室は細胞培養をがんがんするラボではないので血清のロットチェックはさせてもらえず、、、

まずは
血清の非働化

血清を室温で解凍
ウオーターバスを56℃に設定し、血清のボトルを肩までつけて30分
冷蔵庫で保存


次は
冷凍ストック (自家製) からの起こし方

5% FBS in Sf-900II培地を28度に温めておく
細胞の冷凍ストック (1x107 cells /ml x 1ml) を30℃のウオーターバスで急速解凍
ストックが溶けたらアイスボックスにつきさす

T75フラスコに11mlの培地を入れ、フラスコを湿らせた後に細胞を全量加えてピペッティングで混ぜる
28度のインキュベーターで1時間置いて細胞を接着した後に培地を抜き、新しい培地を12ml加える
24時間後に再度培地交換

invitrogenから買った細胞を起こすときは0.25x107cellsをT75フラスコにまくといいかも

自家製ストックとは細部の生存率がだいぶ違うので、、、


細胞の継代

顕微鏡で観て細胞がミチミチになっていたら継代のタイミング
培地を抜き、新しい培地を12ml加える、メスピペットを使ってピペッティングで細胞をはがす
必要であれば細胞をカウント
当ラボでは1x106 cells/ml x 12mlにすると、2-3日後に、0.5x106 cells/ml x 12 mlにすると3-4日後に継代することになります

普段はディスポのピペットを使っています。しかし先っぽが太いため、水圧？がかからないため細胞をうまくはがせません。ですので細胞をはがすときだけメスピペットを使っています。


トランスフェクション等はまた後ほど