バキュロウイルス発現系

invitrogenのBac-to-Bac Baculovirus Expression Systemを使用しています。

これはAcNPVのゲノムに大腸菌の複製起点を導入したbacmid (たぶんbaculovirusとplasmid をくっつけた造語) に大腸菌内でトランスポゾンを使って目的の遺伝子発現ユニットを入れるシステム。

bacmidをSf9にトランスフェクションしてあげると、ウイルス粒子ができでくるので、それをSf9にインフェクションしてあげるとウイルスを増やせたり、目的タンパク質を発現させることができます。



まずは、pFastbacに目的遺伝子を入れます。
特に注意することはなく、ポリへドリンプロモーターとポリA付加シグナルの間にスタートコドンからストップコドンだけを入れればOK。コザックシークエンス等はいりません


プラスミドができたらDH10BACという大腸菌に導入
DH10BACはbacmidとトランスポゼースを乗っけたプラスミドを持っています。
DH10BACのコンピは一度invitrogenから買えば、その後はコンピを自作して使えます。


回復培養は37°Cで4時間
この間にトランスポゾンでbacmidを組み換える

培養液30 µl、1 M IPTG 30 µl、2% X-gal 30 µlを クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ゲンタマイシンの入ったLB プレートにまく。

37°Cで2日間培養
1日ではコロニーが青くなりません

白コロニーをピックし、トランスフェクショングレードのミニプレップやミディプレップキットでbacmidを調製
僕はqiagenのplasmid mini kitを使っています。

本当に組み換えが起こったbacmidかを確認するためには、M13FWとM13RVプライマーを使ってPCRをかければ判断できます。
今のところ、ハズレを引いたことはありませんが、もしもがあると嫌なので毎回PCRで確認しています