Sf9細胞の培養方法とバキュロウイルスを使ったタンパク質の発現のメモ

Sf9細胞 Spodoptera frugiperda (JE Smith) ツマジロクサヨトウ 卵巣由来
細胞はインビトロジェンのSf9 cells in Sf-900II SFM
培地は、Sf-900II SFM
血清は、GibcoのFetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, US originを使ってます

インキュベーターは28度にあわせてあります

今の研究室は細胞培養をがんがんするラボではないので血清のロットチェックはさせてもらえず、、、

まずは
血清の非働化

血清を室温で解凍
ウオーターバスを56℃に設定し、血清のボトルを肩までつけて30分
冷蔵庫で保存


次は
冷凍ストック (自家製) からの起こし方

5% FBS in Sf-900II培地を28度に温めておく
細胞の冷凍ストック (1x107 cells /ml x 1ml) を30℃のウオーターバスで急速解凍
ストックが溶けたらアイスボックスにつきさす

T75フラスコに11mlの培地を入れ、フラスコを湿らせた後に細胞を全量加えてピペッティングで混ぜる
28度のインキュベーターで1時間置いて細胞を接着した後に培地を抜き、新しい培地を12ml加える
24時間後に再度培地交換

invitrogenから買った細胞を起こすときは0.25x107cellsをT75フラスコにまくといいかも

自家製ストックとは細部の生存率がだいぶ違うので、、、


細胞の継代

顕微鏡で観て細胞がミチミチになっていたら継代のタイミング
培地を抜き、新しい培地を12ml加える、メスピペットを使ってピペッティングで細胞をはがす
必要であれば細胞をカウント
当ラボでは1x106 cells/ml x 12mlにすると、2-3日後に、0.5x106 cells/ml x 12 mlにすると3-4日後に継代することになります

普段はディスポのピペットを使っています。しかし先っぽが太いため、水圧？がかからないため細胞をうまくはがせません。ですので細胞をはがすときだけメスピペットを使っています。


トランスフェクション等はまた後ほど