Sf9のトランスフェクション

トランスフェクション試薬:X-treme GENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche)
使用する前に冷蔵庫から出し、室温へと戻しておく


細胞がコンフルになったら、細胞を5% FBS in Sf-900II SFMではがし、細胞数をカウント

細胞を6 well プレートの各ウエルに1x10⁶  x2mlの細胞をまく。


細胞が接着するのを待っている間に、トランスフェクション試薬の用意。

Sf-900II SFM 100 (血清なし) 100 µl にX-treme GENE9を3 µl 加えピペッティングで混合
さらに組み換えbacmidを1 µg 加え、室温で15分間静置。

このインキュベート時間に細胞が6 wellプレートに接着しているはず。


トランスフェクション試薬を全量各ウエルに加え、28°Cで72時間培養。
培養上清を回収、遠心分離 (300xg, 2 min) し、上清をP1ウイルスストックとします。

トランスフェクションによりbacmidが細胞内に入ると、ウイルスゲノムの複製、ウイルス粒子の産生が起こることで細胞の増殖が停止するのと、48時間後くらいから細胞が浮いてきます。

ネガティブコントロール区をとっておくと比較できるので安心です。

また、発現させたいタンパクがタグ付であったり、目的タンパクの抗体があればウイルス回収後に細胞を回収、破砕してやれば、ウエスタンで発現を確認しておくことができます。


ウイルスの増幅

前述の方法で回収したウイルス (P1ウイルス) では量に限りがあるため、P1ウイルスをSf9に感染させ、ウイルスを増幅します。

上記の方法でSf9を6 wellプレートにまきます。

細胞が6 well プレートに接着したらP1ウイルスを100 µl添加し、28°Cで72時間培養し、培養上清を回収、遠心し、P2ウイルスストックとします。

P1ウイルスの添加量は僕の系では100 µlでうまくいっているのですが、ウイルスのタイターをプラークアッセイ等で確認してやる方がいいと思います。

タンパク質の発現

1.2x10⁷の細胞を、T75フラスコにまき、接着させる

P2ウイルスを200 µl加え、28°Cで72時間培養。

セルスクレーパーで細胞を回収し、遠心分離で細胞を回収

PBSで細胞を洗浄、超音波破砕、遠心分離し上清を回収

目的に応じて精製等のステップへ


ウイルスの最適な量は目的タンパクによって異なるのでウイルスの量を何点かとってベストな量を探すのがいいと思います。

また、P2ウイルスのタイターを測っておいたほうが後々再現するのにいいかと思います。