コンピテントセルの調製 (井上法)

1日目
-午前中のうちに大腸菌をLB培地に植菌、37°Cで培養
-SOB培地とtransformation bufferを調製しておく
-夜、帰る時に大腸菌の培養液1 mLを100 mLのSOB培地に植継ぎ、18°Cで培養
　　　バッフル付フラスコか、坂口フラスコを用いる

2日目
-OD600を確認
　　　0.55がベストなようだが、多少違っても充分なコンピテンシーを確保できる
-50 mLのファルコンチューブ2本に培地を回収し、遠心分離 (2500g, 10 min, 4°C)
-上清を捨て、氷冷したtransformation buffer 20 mlを各チューブに加え、懸濁する
　　　ボルテックスやピペッティングではなく、チューブを旋回させ懸濁する。
-遠心分離 (2500g, 10 min, 4°C) し、上清を捨てる
-再度、氷冷したtransformation buffer 5 mlを各チューブに加え懸濁し、一つのチューブにまとめる
-DMSO 750 µlを加え、氷上で10分間静置
　　　この間に液体窒素をアイスボックスにいれておく
-100 µlずつエッペンチューブに分注し、液体窒素に投入急速凍結
-エッペンチューブを回収し、-80°Cで保存

コンピテンシーの確認
一応、自作したコンピテントセルはコンピテンシーを確認しておくと安心

-コンピテントセルを氷上で解凍し、10pgのpUC19を加える
-氷上で20分静置し、42°Cで60分間インキュベートし、氷上で2分静置
-SOCを1 ml加え、37°Cで20分回復培養
-集菌し、全量をLB-amp プレートへまき、37°Cで一晩培養
-コロニー数をカウント
　　　100個ぐらいでギリギリ使えて、1000個を超えると普通の実験で困ることは一切ないと思います。ちなみに100個で10⁷ cfu/µg、1000個で10⁸ cfu/µg
-コンピテンシーの単位は colony formation unit (cfu)/µg (plasmid)

transformation buffer 
MnCl2・4H2O             5.44g             55 mM

CaCl2・2H2O             1.10g             15 mM

KCl                               9.34g              250 mM

PIPES (0.5M pH6.7) 10 ml              10 mM

up to 500 ml

フィルター滅菌、分注して-20°Cで保存可能